流式细胞术实验方案与故障排除

♦  Fc受体阻断剂（Fc受体阻断抗体或IgG溶液）

♦ 红细胞裂解液［Flow Cytometry Human Lyse Buffer

（10X；R&D Systems货号FC002）或Flow Cytometry Mouse

  Lyse Buffer（10X；R&D Systems货号 FC003）或类似产品］

♦ 细胞染色缓冲液Flow Cytometry Staining Buffer（R&D Systems货号FC001，或含有BSA和叠氮化钠的类似缓冲液）

♦ 流式荧光标记抗体

♦ 同型对照抗体

♦  FACS™管（5 mL圆底聚苯乙烯管）

♦ 移液器和吸头

♦ 离心机

1、样品制备：

a）对外周血细胞进行染色时，应当将全血收集到抗凝管中（EDTA或肝素）。用染色缓冲液洗涤细胞三次，500 x g离心5分钟，去除污染的血清成分。

b）在染色来自活化细胞培养物的细胞系或细胞时，应先500 x g离心5分钟，染色缓冲液洗涤细胞三次，去除培养基中可能存在的残留生长因子。

c）需要胰蛋白酶消化才能与基质分离的细胞应当放在振摇平台上，加入培养基继续孵育1-2小时，促使受体再生。振摇平台的使用可防止细胞再次粘附在基质上。

注意：需要开展滴定实验，以确定最佳的试剂量。

2、收集细胞，并向FACS管中加入1x10⁶个细胞/100 μL。使用IgG（1 μg lgG/10⁶个细胞）或Fc阻断抗体在室温下孵育15 min。

注意：切勿清洗此反应中的过量阻断试剂。

3、加入标记抗体或同型对照抗体并混匀。在室温下避光孵育细胞30分钟。

4、用染色缓冲液洗涤细胞，去除未结合的抗体。300 x g离心细胞5分钟，弃上清液。再加入2 mL染色缓冲液，重悬细胞。重复洗涤细胞两次。

注意：如果染色全血样本，此时应使用红细胞裂解液裂解红细胞。

5、红细胞的裂解：向每管中加入2 mL 1X人（R&D Systems货号FC002）或小鼠（R&D Systems货号FC003）裂解液并混合，在室温下避光孵育10分钟。再次混匀细胞，并继续孵育10分钟。如上文第4步所述，离心细胞并用染色缓冲液洗涤细胞。

注意：如果使用未标记的一抗，此时应使用适当的二抗来孵育。避光孵育20-30分钟，并按照第4步洗涤细胞。

6、将细胞重悬在200-400 μL染色缓冲液中，上机分析。

图23为染色小鼠脾细胞B220和CD3的示例（图1）

图1.检测小鼠脾细胞B220/CD45R的表达。

A）使用Rat Anti-Mouse CD3 PE-conjugated Monoclonal Antibody（R&D Systems货号FAB4841P）和Rat Anti-Mouse B220/CD45R APC-conjugated Monoclonal Antibody（R&D Systems货号FAB1217A）或B）Rat lgG2A APC-conjugated isotype control antibody（R&D Systems货号IC006A）对小鼠脾细胞进行染色。

♦Fc受体阻断剂（Fc受体阻断抗体或IgG溶液）

♦PBS（1X）: 0.137 M NaCl、0.05 M NaH₂PO₄、pH 7.4或Hank's平衡盐溶液（HBSS；1X）

♦细胞固定液Flow Cytometry Fixation Buffer（R&D Systems货号FC004，或含1-4%甲醛的类似溶液）

♦细胞膜透化缓冲液Flow Cytometry Permeabilization Buffer/Wash Buffer I（1X；R&D Systems货号FC005，或含有皂苷或Triton X-100等透化剂的类似溶液）

♦胞内抗体

♦同型对照抗体

♦FACS™管（5 mL圆底聚苯乙烯管）

♦移液器和吸头

♦离心机

1、收集细胞，加入2mL 1 X PBS（或HBSS）洗涤细胞两次，以300 x g离心5分钟，然后弃上清。

注意：表面抗原的染色可在此时进行（在表面染色之前进行Fc受体阻断）。

2、向FACS管中加入1x10⁶个细胞/100 μL。加入0.5 mL预冷的细胞固定液*并混匀。在室温下孵育10分钟。间歇混合细胞，以便保持单细胞悬液的状态。

*注意:固定液的百分比需要根据待测的胞内标志物来优化。建议的范围在1-4%（4%为储液）。

3、离心细胞，并弃去固定液。如第1步所述，用1 X PBS（或HBSS）洗涤细胞两次。用2 mL细胞膜透化缓冲液洗涤细胞。离心，弃上清液。

4、用IgG或Fc阻断抗体封闭细胞受体10-15分钟。加入标记抗体或同型对照抗体并混匀。在室温下避光孵育细胞30分钟。

注意：由于皂苷介导的细胞透化是一个可逆的过程，故胞内染色的过程中始终需要细胞膜透化缓冲液存在。

5、如第3步所述，用细胞膜透化缓冲液洗涤细胞两次。

注意：如果使用未标记的一抗，此时应使用适当的二抗来孵育。避光孵育20-30分钟，并按照第3步洗涤细胞。

6、将细胞重悬于200-400 μL 1 X PBS（或HBSS）中，上机分析。

下图为使用IFN-γ抗体对经过刺激的人PBMC进行胞内染色的示例（图2）

图2.利用含皂苷细胞破膜缓冲液染色胞内IFNγ。使用细胞刺激混合剂（Tocris Bioscience货号5476/1 ML）刺激人PBMC三小时。然后收集细胞，用可固定的细胞活力染料进行染色，再用CD3 AF700（R&D Systems货号FAB100N）、CD45RA AF488 （R&D Systems货号FAB1430G）和（a）Ms lgG2a AF647 isotype control antibody（R&D Systems货号IC003R）或（b）CD69 AF647 antibody（R&D Systems货号IC0041R）进行表面染色。然后洗涤细胞，用1%甲醛固定和透化，再用Ms lgG2b PE同型对照抗体（a）或IFNγ PE抗体（b）进行胞内染色。

♦ Fc受体阻断剂（Fc受体阻断抗体或IgG溶液）

♦ PBS（1X）: 0.137 M NaCl、0.05 M NaH₂PO₄，pH 7.4

♦ 细胞染色缓冲液Flow Cytometry Staining Buffer（R&D Systems货号FC001）

♦ FlowX™ FoxP3/转录因子染色试剂盒（R&D Systems货号FC012）

♦ FoxP3固定/转录因子浓缩液（4X）

♦ FoxP3固定/转录因子稀释液（1X）

♦ FoxP3/转录因子透化和清洗液（10X）

♦ 胞内抗体

♦ 同型对照抗体

♦ FACS™管（5 mL圆底聚苯乙烯管）

♦ 移液器和吸头

♦ 离心机

1、用2 mL细胞染色缓冲液（R&D Systems货号FC001）或其他含BSA的缓冲液洗涤PBMC或小鼠脾细胞（每个样品含1x10⁶个细胞），使用5 mL流式管以300 x g离心5分钟。

2、用IgG阻断Fc受体 (1 μg lgG/10⁶个细胞)，2-8°C封闭15分钟。

3、用所需的抗体进行表面染色，在2-8°C下孵育30分钟。

4、用预冷的1 X PBS清洗细胞两次。在洗涤过程中，用FoxP3/转录因子固定稀释液来稀释FoxP3/转录因子固定浓缩液（4X），制备新鲜的1 X FoxP3/转录因子固定缓冲液（具体过程是将100 μL FoxP3/转录因子固定浓缩液与300 μL FoxP3/转录因子固定稀释液混合）。

5、用新鲜配制的1 X FoxP3/转录因子固定缓冲液重悬细胞，每管加入0.5 mL。在2-8°C下孵育30分钟。在孵育过程中，用双蒸水稀释FoxP3/转录因子透化和清洗液（10X），制备新鲜的1 X FoxP3/转录因子透化和清洗液（具体过程是将100μL FoxPS/转录因子透化和清洗液（10 X）与900 μL双蒸水混合），放置在2-8°C备用。

6、用新鲜、预冷的1XFoxP3/转录因子透化和清洗液清洗细胞两次。

7、用Fc阻断试剂再次封闭细胞Fc受体10-15分钟，然后向细胞中加入FoxP3或其他转录因子的抗体，在2-8°C下孵育30分钟。

8、用预冷的1 X FoxP3/转录因子透化和清洗液洗涤细胞一次。

9、用细胞染色缓冲液重悬细胞，上机检测。

图3.小鼠脾细胞中FoxP3的检测。小鼠脾细胞经过mCD4 PE和mCD25 FITC（R&D Systems货号FAB554P、FAB9164）的表面染色。为了促进细胞内染色，首先固定细胞，接着用FoxP3/转录因子试剂盒中的缓冲液透化细胞。再使用FoxP3 APC （R&D Systems货号IC8214A）或Rabbit IgG APC isotype control（R&D Systems货号IC1051A，图中未显示）进行细胞内染色。

♦Fc受体阻断剂（Fc受体阻断抗体或IgG溶液）

♦PBS（1X）: 0.137 M NaCl、0.05 M NaH₂PO₄、pH 7.4

♦细胞染色缓冲液Flow Cytometry Staining Buffer（R&D Systems货号FC001）

♦细胞固定液Flow Cytometry Fixation Buffer（R&D Systems货号FC004）

♦甲醇（-20°C）

♦磷酸化抗体

♦同型对照抗体

♦FACS™管（5 mL圆底聚苯乙烯管）

♦移液器和吸头

♦离心机

注意：表面抗原的染色可在此时进行（首先进行Fc受体封闭）。

注意：如果使用未标记的一抗，此时应使用适当的二抗避光孵育20-30分钟，并按照第3步洗涤细胞。

1、快速收集细胞，加入2mL 1 x PBS（或HBSS）清洗细胞两次，以300 x g离心5分钟，然后弃上清液。

2、向FACS管中加入1 x 10⁶个细胞/100 μL。加入0.5 mL预冷的细胞固定液*并混合。室温下孵育10分钟。间歇混合细胞保持单细胞悬液的状态。

*注意：固定液的百分比需要根据待测的磷酸化标志物来优化。建议的范围在1-4%（4%为储液）。

3、以300 x g离心细胞5分钟，弃固定液。如第1步所述，用1 X PBS（或HBSS）洗涤细胞两次。用900 μL -20°C甲醇重悬细胞。在4°C下孵育30分钟。

2、以300 x g离心细胞5分钟，弃上清液。用细胞染色缓冲液洗涤细胞两次。

5、用Fc阻断剂封闭细胞10-15分钟，然后加入荧光标记的磷酸化抗体或同型对照抗体，并混匀。在室温下避光孵育细胞30分钟。

6、用细胞染色缓冲液洗涤细胞两次。

7、将细胞重悬于200-400 μL染色缓冲液中，上机分析。

下图为使用STAT2磷酸化抗体对经IFN-α处理的Daudi细胞进行细胞内染色的示例（图4）。

图4. Daudi人细胞系中STAT2的检测。Daudi人Burkitt's淋巴瘤细胞系未经处理（空心直方图）或经过500 U/mL Recombinant Human IFNα A （R&D Systems货号11100-1，实心直方图）处理20分钟，然后用兔抗人磷酸化STAT2（Y689）单克隆抗体（R&D Systems货号MAB2890）和荧光素标记的抗兔IgG二抗（R&D Systems货号F0112）染色。为了促进细胞内染色，用细胞固定液（R&D Systems货号FC004）固定细胞，并用90%甲醇进行透化处理。