看完这篇，外泌体被你狠狠拿捏了！(文末有彩蛋）

外泌体研究中的细胞培养，能否先用正常培养液养到70%再换无外泌体血清的培养液？

Q2

推荐用含有无外泌体血清的培养液培养细胞，如果条件有限，可以考虑先将细胞使用有外泌体血清培养，细胞长到一个合适的密度如70%-80%左右时，移除培养液，37℃预热的PBS清洗细胞3-5遍，换无血清的培养液，收集培养上清，分离外泌体。

外泌体标志物鉴定用哪个marker做WB好？

Q4

外泌体研究使用血浆样本进行实验较好。血清是在血液凝固之后收集的液体，其中少了纤维蛋白原，凝血因子，以及多了很多凝血产物。有研究发现，在凝血过程中血小板会分泌大量外泌体，而血清中有接近50%的外泌体来源于这些额外的分泌；同时，血清凝固时会形成纤维网，将本来血液中的外泌体包裹在凝血块中。这一正一反，就导致血清中的外泌体与常规疾病之间的关联性低于血浆。另外，血浆=血液-血细胞 ；血清=血浆-纤维蛋白原-凝血因子。所以在特殊情况下，如果研究与血小板相关的疾病的时候，血清反而更适合。

分离细胞培养上清中的外泌体需要多少体积上清？

Q6

根据下游实验外泌体用量，选用不同的样本体积和方法。一般情况由于血清血浆样本中外泌体的含量相对较高，完成一次蛋白组学实验，试剂盒法所需样本起始体积建议>200ul。排阻色谱柱法所需样本起始体积建议>500ul，而超速离心法所需样本起始体积建议>2ml之间。其他实验需进行预实验探索，与下游检测技术也有关系，一般基因芯片的样本用量要少于测序。

为什么超离后看不到外泌体沉淀？

Q8

负染电镜结果中外泌体的形态理想状态下应该呈现明显的茶托状！边缘有一圈略微更明亮的亮圈。无膜结构的圆球形，很可能是脂蛋白颗粒（LDL）或者抱团的蛋白质。

待提取外泌体的细胞培养液如何保存，外泌体样品又如何保存？

Q10

目前外泌体的分离手段很难获得十分纯净而且单一的外泌体样品，而且没有任何一个单一实验可以确定外泌体的存在。

比如超速离心和凝胶排阻层析都不能很好地去除血清中脂蛋白颗粒，即使使用梯度密度离心也是一样。所以需要三项鉴定来确定纯化的产物为外泌体。

再来看三种方法，电镜可以看到形态，但是包括支原体、铁蛋白聚团、溶酶体等它们形态很类似；NTA是一种测算粒子群体直径分布和数量的计算方法，而观测靠的是粒子对光路的影响，这一方法不能反映粒子形态，无论样品是外泌体还是纳米微珠，它都会算作粒子，因此也不能区分外泌体；WB是鉴定的是外泌体的一些标志物蛋白，但是目前的这些标志物蛋白只是会在外泌体里富集，而并不是外泌体所特有的，诸如CD63、ALIX等在细胞中都有，在一些细胞碎片、溶酶体、胞内体中也大量存在。因此需要三种方法共同进行相互验证。

Q11

目前外泌体的定量方法主要有三种：

1）通过BCA等方法对分离得到的外泌体进行蛋白定量，用测得的蛋白量来反映外泌体的量。

2）通过纳米粒子计数仪对外泌体的粒子数进行计算，使用粒子数目来反映外泌体的数量。

3）使用外泌体表面特定的某一个标志物的ELISA定量数据来反映外泌体的数量，比如使用CD63 CD81等。

对于定量方法的选择，三者选一即可，论文前后保持一致即可。BCA定量容易有杂蛋白影响、纳米粒子计数也存在一定的误差、ELISA分析的外泌体蛋白通常在其他膜结构和游离系统中都会有。