WB常见问题
胶片一片空白，是怎么回事？
如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
1）二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；
2）ECL底物中H2O2不稳定，失活；
3）ECL底物没覆盖到相应位置；
4）一抗选择不当；
5）二抗失活。
背景高是什么原因？
条带形状不好看是什么原因？
蛋白条带位置（大小）不对应该怎么办？
有很多杂带应该如何处理？
背景有黑色斑点、不均匀白色斑点、暗背景上白色带
可能的原因有：
1)抗体与封闭试剂反应，建议使用前过滤封闭试剂；
2)HRP含量过高，建议降低酶联二抗的浓度；
3)HRP偶联二抗中有聚集体，建议过滤二抗试剂，去除聚集体；4) 抗体分布不均匀，建议孵育抗体时使用摇床；
细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？
一般5×10^6就足够。
为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？
目的带很弱，该如何加强呢？
1）可以加大抗原上样量，这是最主要的；
2）也可以将一抗稀释比例降低；
3）还可以延长曝光时间。
我做的蛋白质分子量很小(10KD)，怎么做WB?
1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系；
2）也可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。
如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？
可以浓缩样品，也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。
WB中抗体的可以重复应用吗？
抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
上下槽缓冲液有何要求，怎样能达到最佳效果？
无特殊要求。但一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。
做Western Blot时，提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的A厂家的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个B厂家的一抗仍不行。是什么原因？
我用的是可视marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。
一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。
WB实验结果奇葩情况一览
