干货分享 | Co-IP实验流程及对照设置

蛋白样品通常通过裂解细胞得到。

Co-IP实验通常有两种，一种为内源性蛋白相互作用验证，另外一种为非内源性蛋白相互作用验证，内源性相互作用是指两蛋白相互作用在细胞内发生，即通过质粒共转染的方式将两种蛋白转染至同一细胞内表达，表达完成后收集细胞进行裂解得到蛋白样品。非内源性相互作用两蛋白相互作用在细胞外发生，即将含有靶蛋白的动植物组织、器官进行预处理及细胞裂解获得细胞裂解液，随后将诱饵蛋白（通常为重组表达纯化获得）加入细胞裂解液中，得到蛋白样品。

利用磁珠偶联抗体沉淀诱饵蛋白：

在样品中加入磁珠偶联抗体，抗体会与诱饵蛋白结合，利用磁铁将磁珠拉下，同时诱饵蛋白会一起被沉淀出来。如果存在与诱饵蛋白的相互作用的靶蛋白，也会被沉淀下来。如果没有诱饵蛋白的特异性抗体，可以给诱饵蛋白加上标签（Myc、HA、Flag等），然后利用标签抗体沉淀蛋白。

得到沉淀后，需要验证沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE将蛋白复合物分离，随后利用WB检测是否存在靶蛋白（如果靶蛋白的分子量是已知的，可以直接用SDS-PAGE检测是否存在靶蛋白）。

为了确保最终得到的结果是天然状态下的相互作用，而不是由于某些方面造成的人工相互作用（也就是“假阳性”），在Co-IP的实验设计过程中，需要设置正确的对照。

假设Co-IP实验的实验组为“磁珠+抗X抗体+靶蛋白X+目的蛋白Y”，则可能出现的“假阳性”及对应需要设置的实验对照如下表所示：

上述为了避免出现“假阳性”的对照称为阴性对照，除此之外Co-IP实验还会设置一个阳性对照组（Input组），Input组为直接利用抗体X（抗体Y）对细胞裂解液进行WB检测，验证细胞裂解液中存在蛋白X（抗体Y）。

在某些Co-IP实验中，实验人员会把IP后的上清分别进行蛋白X和蛋白Y的WB检测，该对照组称为output组。

利用内源性Co-IP实验为验证两个蛋白是否存在已知作用，如果最终的结果为阳性，则可以证明两个蛋白之间存在相互作用；但如果结果为阴性，无法证明两个蛋白之间不存在相互作用，也有可能是蛋白在细胞内表达量低等原因导致。因此在进行内源性Co-IP验证两个蛋白是否存在相互作用时，建议先做过表达Co-IP作为对照。